62/2000 Proteja a saúde de bebês e crianças pequenas! A cromatografia iônica Wanyi determina sete tipos de mil humanos

Prefácio

Os oligossacarídeos do leite humano (OMS) são um grupo de oligossacarídeos com um grau de polimerização não superior a 3, presentes naturalmente no leite humano.São o terceiro componente sólido mais abundante no leite humano.Os biofármacos, após a lactose e a gordura, regulam a flora intestinal, favorecendo em especial a colonização das Bifidobacteriaceae no intestino infantil, mantendo simultaneamente a saúde intestinal.apoiar o desenvolvimento do sistema imunológico e do cérebroDesde que a primeira fórmula infantil enriquecida com HMO foi lançada nos Estados Unidos em 2015,uma ampla gama de fórmulas infantisA partir de 1 de junho de 2023, os EUA e a UE aprovaram sete HMO para uso:2'-fucosilactose, 3'-fucossilactose, difossilactose, lacto-N-neotetraose, lacto-N-tetraose, 3'-sialsilactose e 6'-sialsilactose.

Entre os métodos comuns de detecção de HMO, a cromatografia líquida requer uma reação de derivatização antes da detecção, envolve uma preparação de amostra complexa e os reagentes de derivatização são frequentemente tóxicos;A natureza labil ao calor dos HMO também leva a uma baixa resposta e uma fraca repetibilidade no LC-MS.Em contrapartida, a cromatografia iónica com detecção amperométrica de carboidratos oferece uma preparação de amostra simples, uma elevada resposta e uma boa repetibilidade, dando-lhe claras vantagens para a análise HMO.Esta nota de aplicação utiliza hidróxido de sódio preparado manualmente, acetato de sódio e água ultrapura como eluentes, e utiliza o cromatógrafo iônico WAYEAL IC6300 para determinar os HMOs na fórmula para lactentes.alta sensibilidade e boa linearidade, fornecendo uma referência útil para a detecção de OMS nos alimentos.

Palavras-chave: cromatógrafo iónico; oligossacarídeos do leite humano; detector amperométrico.

1Instrumentos, Equipamentos e Reagentes

1.1 Reagentes e normas

Quadro 1. Lista de reagentes e normas

1.2 Materiais de laboratório e equipamento auxiliar

• 1.2.1 Balança analítica (0,1 mg de leitura);
• 1.2.2 Banho de água termostático;
• 1.2.3 Centrífuga;
• 1.2.4 Filtros de membrana de poliéteresulfono aquoso (0,45 μm);
• 1.2.5 Água ultrapura;
• 1.2.6 Dispositivo de filtragem a vácuo;
• 1.2.7 Cartuchos de pré-tratamento de extração de fase sólida (SPE) RP;
• 1.2.8 seringas descartáveis (20 ml, 5 ml).

2Método Experimental

2.1 Preparação da solução

• 2.1.1 200 mmol/L de solução de hidróxido de sódio: pipeta de 10,5 ml de 50% de NaOH, diluída com água até 1000 ml e filtrada sob vácuo.
• 2.1.2 Solução misturada de 75 mmol/L de NaOH e 250 mmol/L de acetato de sódio: pesar com precisão 20,51 g de acetato de sódio, dissolver em água e transferir para um frasco volumétrico de 1000 ml; precisão na pipeta 3.95 ml de 50% de NaOH, diluir para 1000 ml com água ultrapura e filtrar sob vácuo.
• 2.1.3 Solução de 3% de ácido sulfosalicílico: pesar 3,0 g de ácido sulfosalicílico, dissolver em água e diluir até 100 ml (preparar fresco).
• 2.1.4 Solução de base-padrão misturada: pesar com precisão 5 mg de 2'-fucosilactose, 3'-fucosilactose, 3'-sialillactose, 6'-sialyllactose, lacto-N-tetraose e lacto-N-neotetraose (com a precisão máxima de 0.1 mg), colocar num frasco volumétrico de 10 ml, dissolver em água e diluir até à marca para preparar uma mistura de 500 mg/l. Pesar separadamente 1 mg de difusocilsactose (com a maior precisão de 0,1 mg),Colocar num frasco volumétrico de 10 ml, dissolver e diluir até à marca para preparar um estoque de 100 mg/l.
• 2.1.5 Soluções de trabalho normalizadas misturadas: pipetar com precisão a solução de base mista (2.1.4) em frascos volumétricos e diluir com água para preparar soluções de trabalho misturadas de 2'-FL, 3'-FL, 3'-SL, 6'-SL, LNT, LNnT e DFL a 0,5, 2, 4, 6, 8 e 10 mg/ l. Prepare- se fresco antes de utilizar.

2.2 Preparação da amostra

Pesar aproximadamente 2,0 g de amostra num pequeno copo, misturar bem com 50 ml de água morna (cerca de 50 °C), adicionar 40 ml de solução de ácido sulfosalicílico a 3%,transferir e diluir para 100 ml num frasco volumétrico, e sonicar durante 10 min. Filtrar através de papel de filtro ou centrífuga (12.000 r/min, 15 min).descartar os primeiros 3 ml e recolher o eluado para análiseAntes da utilização, condicionar o cartucho RP SPE com 20 ml de metanol seguido de 15 ml de água e equilibrar durante 30 min.

2.3 Condições experimentais

2.3.1 Condições de cromatografia iónica

3Resultados

3.1 Alcance linear

Analisou-se uma aliquota adequada de cada solução de trabalho mista padrão, com um intervalo linear de 0,5 a 10 mg/l;Os desvios entre as concentrações medidas e as concentrações nominais estavam dentro do desvio máximo admissível, os valores de R2 foram superiores a 0.999, e todos os componentes mostraram boa linearidade.

Quadro 2. Intervalos lineares dos compostos

Figura 1. Cromatogramas de calibração sobrepostos das sete normas HMO

3.2 Resultados dos ensaios com amostras

As amostras 1 e 2 foram testadas após uma diluição de 10 vezes. O teor de cada um dos sete HMO foi calculado do seguinte modo: X é o teor na amostra (mg/100 g);c é a concentração na solução da amostra a partir da curva de calibração (mg/L)V é o volume constante (mL); m é a massa da amostra (g); f é o factor de diluição.

Figura 2. Cromatograma iónico da amostra 1 diluída 10 vezes

Figura 3. Cromatograma iónico da amostra 2 diluída 10 vezes

Quadro 3. Resultados dos ensaios com amostras

3.3 Precisão

A solução de trabalho no quarto nível de calibração foi analisada em seis injecções consecutivas nas condições descritas em 2.3.1O RSD dos sete conteúdos HMO foi calculado para avaliar a repetibilidade.

3.3.1 Precisão de repetibilidade padrão

Resultados dos ensaios:

Figura 4. Cromatogramas sobrepostos de injecções de réplicas independentes do padrão de calibração S4

Quadro 4. Precisão de repetibilidade da norma

3.4 Limites de detecção e quantificação

LOD: As aliquotas da solução padrão foram diluídas numa solução mista contendo 10 μg/L 3'-FL, 30 μg/L DFL, 30 μg/L 2'-FL, 22 μg/L LNnT, 67 μg/L LNT, 67 μg/L 6'-SL e 160 μg/L 3'-SL;Foram preparadas e analisadas 20 amostras paralelas.

LOQ: As aliquotas da solução padrão foram diluídas numa solução mista contendo 30 μg/L 3'-FL, 80 μg/L DFL, 90 μg/L 2'-FL, 65 μg/L LNnT, 200 μg/L LNT, 200 μg/L 6'-SL e 500 μg/L 3'-SL;Foram preparadas e analisadas seis amostras paralelas.

Os resultados dos ensaios são os seguintes:

Quadro 5. Resultados S/N para LOD e LOQ das sete OMS

3.5 Especificidade

Adicionaram-se aliquotas (100 μL cada) de soluções-padrão de glicose, frutose, sacarose e maltose a um frasco volumétrico de 10 ml e diluíram-se até à marca com a solução da amostra 2 diluída 67 vezes.A solução foi analisada para verificar se estes açúcares interferiram com os picos dos sete HMOComo se mostra a seguir, os quatro açúcares não apresentaram interferência significativa na determinação dos sete HMO no leite em pó.

Figura 5. Cromatogramas sobrepostos de calibração S6, Amostra 2 e Amostra 2 com quatro padrões de açúcar

4Conclusão

Esta validação utilizou o cromatógrafo iônico WAYEAL para verificar o método de determinação dos OMS nos géneros alimentícios.LNnT, LNT, 6'-SL e 3'-SL elutam todos em 60 min; a sensibilidade satisfaz os requisitos das normas nacionais e os coeficientes de correlação lineares são todos superiores a 0.999. A repetibilidade dos padrões e das amostras é boa. Com exceção das duas sialillactoses, o LOD e o LOQ estão no nível de μg/L. O método tem uma boa especificidade, sem serem encontradas impurezas interferentes,e, em geral, satisfaz os requisitos normalizados.