Determinação da aflatoxina B1, cancerígeno do grupo 1, em culturas oleaginosas pelo sistema Wayeal LCMS-TQ9200 LC-MS/MS

Aflatoxina B₁é um metabolito secundário altamente tóxico produzido principalmente por Aspergillus flavusEntre a família das aflatoxinas, apresenta a mais forte toxicidade e a mais ampla distribuição.Exerce os seus efeitos tóxicos inibindo a síntese intracelular de ADN e ARN e interferindo no metabolismo das proteínas, com um efeito nocivo altamente direccionado no fígado.Em comparação com outras micotoxinas, como a ocratoxina e a patulina, a aflatoxina B₁É extremamente tóxico e tem uma carcinogenicidade bem estabelecida. Carcinógenos do Grupo 1É frequentemente detectada em culturas oleaginosas como amendoim, milho, nozes e óleos vegetais,tornando-se um contaminante prioritário para o controlo da segurança alimentar em todo o mundo.

Contaminação por aflatoxina B₁ocorre normalmente quando as culturas oleaginosas são expostas a condições de alta temperatura e alta umidade durante o plantio, a colheita ou o armazenamento, que promovem o crescimento de fungos.devido às suas propriedades químicas estáveis, aflatoxina B₁não podem ser destruídos por temperaturas de cozimento convencionais, o que leva a problemas recorrentes de resíduos em produtos agrícolas e alimentos transformados.

A ingestão a curto prazo de uma dose elevada pode causar intoxicação aguda, apresentando sintomas como dor abdominal severa, vômitos, icterícia e insuficiência hepática, que podem ser fatais em casos graves.A exposição prolongada a baixas doses leva a acumulação no fígado., induzindo lesões hepáticas crónicas, como fibrose hepática e cirrose, e podem até desencadear cancro hepático primário.e indivíduos com doenças hepáticas preexistentes, estão em maior risco de aflatoxina B.₁Envenenamento.

Na China, a norma nacional GB 2761-2017 (Norma Nacional de Segurança dos Alimentos - Níveis máximos de micotoxinas nos alimentos) especifica os limites máximos de resíduos de aflatoxina B.₁em vários tipos de alimentos. GB 5009.22-2016 (Norma Nacional de Segurança dos Alimentos - Determinação das Aflatoxinas B e G nos Alimentos)fornece métodos oficiais de análise para a determinação da aflatoxina B₁.

A presente nota de pedido descreve o estabelecimento de um método de cromatografia líquida de diluição por isótopos e espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS) para a determinação da aflatoxina B.₁utilizando o sistema Wayeal LCMS-TQ9200 LC-MS/MS.

Palavras chave:Tripla quadrupola; Aflatoxina B.₁Cromatografia líquida de diluição por isótopos - espectrometria de massa em tándem.

1Instrumentos e reagentes

1.1 Configuração dos instrumentos

Quadro 1 Lista de configurações dos instrumentos

1.2 Reagentes e normas

Quadro 2 Reagentes e normas

1.3 Material experimental e equipamento auxiliar

Misturador de vórtice

Centrífugas de alta velocidade

Balanço analítico

Centrífuga

Dispositivos de extração de fase sólida (SPE) (com bomba de vácuo)

Evaporador de nitrogénio

Shaker

2Método experimental

2.1 Preparação da solução

2.1.15 mmol/L Solução de acetato de amónio:Pesar 0,39 g de acetato de amónio, dissolvê-lo em água e diluí-lo até 1000 ml. Misturar bem.

2.1.1 Solução de metanol-acetonitrilo:Adicione 100 ml de acetonitril a 100 ml de metanol e misture bem.

2.2 Pré-tratamento da amostra

2.2.1 Extração de amostras

Passe a farinha de trigo através de uma peneira de ensaio com abertura de 2 mm. Pesar 5 g da amostra (com precisão de 0,01 g) num tubo centrífugo de 50 ml. Adicionar 100μL de solução de trabalho padrão interna de isótopos (100 ng/mL), misturar por vórtice e deixar ficar durante 30 min. Adicionar 20 mL de solução de metanol-água (70+30, v/v), misturar o vórtice,e agitar em um agitado orbital por 20minCentrifugar a 6000 r/min durante 10 min. Recolher o supernatante para posterior utilização.

2.2.2 Purificação da amostra

Transferir com precisão 4 ml do supernatante para um recipiente, adicionar 23 ml de 1% de Tritão X-100 em PBS e misturar bem.

Após o líquido original na coluna de imunoaffinidade ter sido completamente drenado, transferir a solução da amostra acima para um barril de seringa de 50 ml.Ajustar o caudal de modo a que a solução da amostra passe pela coluna de forma constante a uma taxa de 1 ¢3 ml/minApós a solução da amostra ter sido completamente drenada, adicionar 2 × 10 ml de água ao cano da seringa e lavar a coluna de imunoaffinidade a um caudal constante.secar a coluna com uma bomba de vácuo.

Desligue o sistema de vácuo, coloque um tubo de ensaio graduado de 10 ml debaixo da coluna de afinidade imunológica, retire o cano da seringa de 50 ml,e adicionar 2 × 1 mL de metanol para eluir a coluna a um caudal controlado de 1?? 3 mL/minEm seguida, secar novamente a coluna com uma bomba de vácuo e recolher todo o eluado no tubo de ensaio.Evaporar suavemente o eluado até quase secar sob um fluxo de nitrogénio a 50 °C. Adicionar 1 ml da fase móvel inicial, em vórtice durante 30 segundos para dissolver o resíduo.Filtro de membrana de 22 μm, e recolher o filtrado num frasco para auto- amostragem para injecção subsequente.

2.3 Condições experimentais

2.3.1 Método de cromatografia líquida

Coluna: C18, 1.7μM, 2.1×50 mm

Fase de fase móvel: A: solução de metanol-acetonitrilo; Fase B: solução de acetato de amónio 5 mmol/L

Taxa de fluxo: 0,3 ml/min

Temperatura da coluna: 40°C

Volume de injecção: 3μL

2.3.2 Método de espectrometria de massa

Quadro 3 Parâmetros de espectrometria de massa de compostos

Nota: O asterisco (*) indica o íon quantitativo.

3Resultado do experimento.

3.1 Cromatograma padrão

Determinação da aflatoxina B₁e o isótopo padrão interno 13C17-aflatoxina B₁Como se mostra na figura 1, ambos os analisados apresentaram excelentes picos e respostas satisfatórias, satisfazendo os requisitos para a análise experimental.

Fig. 1 Cromatogramas de aflatoxina B₁e o padrão interno de isótopos 13C17- Não.-Aflatoxina B₁

3.2 Alcance linear

An appropriate volume of the standard stock solution and mixed isotope internal standard working solution were accurately transferred and diluted with the initial mobile phase to prepare a series of standard working solutions with aflatoxin B₁Cada solução continha o padrão interno do isótopo numa concentração de 2ng/mL. Foi construída uma curva de calibração utilizando estes padrões.Acima do intervalo linear de 0.5- Não.50 ng/mL e após correcção com 13C 17-aflatoxina B₁como norma interna, os desvios entre a aflatoxina B medida e a nominal₁As concentrações estavam dentro do desvio máximo admissível e o coeficiente de correlação (R) era superior a 0.999, indicando uma excelente linearidade.

Fig. 2 Curva padrão da aflatoxina B₁

3.3 Repetibilidade

Foram injectadas seis vezes consecutivas soluções- padrão em três concentrações (1, 10 e 20 ng/ ml).Os desvios-padrão relativos (DPR) dos tempos de retenção e dos montantes da amostra para a aflatoxina B₁Em concentrações baixas, médias e altas, todos estavam dentro de 5%, satisfazendo os requisitos do experimento.

Quadro 4 Ensaio de repetibilidade da aflatoxina B₁em concentrações baixas, médias e elevadas

3.4 Recuperação de picos

Aflatoxina B₁A amostra foi então analisada por LC-MS/MS. O resultado médio de seis injecções consecutivas foi de 5.147 ng/mLA taxa de recuperação calculada foi de 102,94%, o que satisfaz os requisitos da experiência.

3.5 Resíduo em branco

Após a injecção contínua da solução- padrão de 20 ng/ ml, foi posteriormente injectada uma amostra em branco para avaliar a transferência.

Fig. 3 Cromatograma em branco do composto

3.6 Teste de amostragem

Aflatoxina B₁não foi detectada na amostra A (Fig. 4).

Fig. 4 Cromatograma da aflatoxina B₁Na amostra A

4Conclusão

Neste estudo, foi utilizado um método de cromatografia líquida de diluição por isótopos e espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS) para a determinação da aflatoxina B.₁Foi estabelecida com o sistema Wayeal LCMS-TQ9200 de cromatografia líquida-tandem de espectrometria de massa.Os dados obtidos demonstram que todos os picos cromatográficos apresentam boas formas de picos sem caudaA sensibilidade satisfaz os requisitos experimentais e o coeficiente de correlação (R) é superior a 0.999A repetibilidade em concentrações baixas, médias e elevadas é inferior a 5% e não se observa transferência do sistema após a injecção de amostras de alta concentração.Estes resultados indicam que o método, quando equipado com o sistema Wayeal de cromatografia líquida-tandem de espectrometria de massa, preenche os requisitos para análises qualitativas e quantitativas de rotina das amostras-alvo.