Determinação dos resíduos de antibióticos de amfenicol na carne de frango pelo Wayeal LCMS-TQ9200

Palavras chave:LCMS, anfenicol, segurança alimentar, resíduos de medicamentos veterinários.

1Instrumentos e reagentes

1.1 Lista de configurações do LCMS

Quadro 1 Lista de configurações dos instrumentos

1.3 Materiais de experimentação e equipamento auxiliar

Limpeza ultra-sônica

Misturador de vórtice

Evaporador de nitrogénio para banho de água

Centrífugas de alta velocidade

2Métodos de experimentação

2.1 Preparação da solução

2.1.1 Solução de acetato de etilo amoniado de 2%: tomar 4 ml de água de amônia e diluí-la em 200 ml com acetato de etilo.

2.1.2 Solução de cloreto de sódio de 4%: tomar 4 g de cloreto de sódio, dissolvê-lo em água e diluí-lo até 100 ml.

2.1.3 Solução de n-hexano saturada de cloreto de sódio de 4%: tomar uma quantidade adequada de solução de cloreto de sódio de 4%, adicionar um excesso de n-hexano, misturar, deixar ficar para separação da camada,e tomar a camada superior de n-hexano.

2.1.4 Solução de trabalho mista interna padrão: tomar uma quantidade adequada da solução de base mista interna padrão,diluir com 20% de metanol para obter cloramfenicol-D5 a 10 ng/ml e outros padrões internos (florfenicol-D3, tiamfenicol-D3 e florfenicol-amina-D3) em 50 ng/ml cada.

2.2 Pré-tratamento da amostra

2.2.1 Extração da amostra: pesar 2 g da amostra (com precisão de ±0,01 g), adicionar 100 μl de solução de trabalho interna mista, fazer o vórtice durante 1 minuto, adicionar 10 ml de 2% de solução de acetato de etilo amoniado,Vórtice durante 10 min., centrifugar a 8000 rpm durante 5 minutos e recolher o supernatante. Adicionar mais 10 ml de 2% de solução de acetato de etilo amoniado ao resíduo e repetir o procedimento de extracção.Combinar os dois supernatantes, evaporar até secar sob um fluxo de nitrogénio a 50°C e reservar para utilização.

2.2.2 Purificação da amostra: Adicionar 3 ml de solução de cloreto de sódio a 4% ao resíduo de purificação, em vórtice para dissolver, adicionar 5 ml de solução de n-hexano saturada de cloreto de sódio a 4%, em vórtice durante 30 segundos,Centrífuga a 8000 rpm durante 5 minutos, e descartar a camada superior de n-hexano. Repita o procedimento de desengraçamento uma vez. Adicionar 5 ml de 2% de solução de acetato de etilo amoniado, vórtice durante 10 min, centrifugar a 8000 rpm durante 5 min,e recolher o supernatanteAdicionar ao resíduo mais 5 ml de 2% de solução de acetato de etilo amoniado e repetir o procedimento de extracção.adicionar 1 ml de solução de metanol a 20%, vórtice por 30s, filtrar através de uma membrana, e aguardar análise instrumental.

2.3 Condições de experimentação

2.3.1 Condições de cromatografia líquida

Coluna de cromatografia: C18 1,7 μm 2,1x50 mm

Fase móvel: A: acetonitrilo; B: 2 mM de formato de amónio na água

Taxa de fluxo: 0,3 ml/min

Temperatura da coluna: 40 °C

Volume de injecção: 5μL

2.3.2 Condições de espectrometria de massa

Quadro 3 Parâmetros da fonte iónica

3Resultado do experimento.

3.1 Cromatograma padrão

A determinação de quatro antibióticos amidas e dos seus padrões internos foi concluída em 6 minutos.e cada composto demonstrou uma resposta satisfatória, satisfazendo os requisitos experimentais.

Figura 1 Cromatograma de 4 antibióticos amfenicóis e padrão interno (cloramfenicol 0,2 ng/ml, outros antibióticos 1 ng/ml)

3.2 Alcance linear

Tomar uma quantidade adequada da solução-padrão misturada com amido-alcool e diluí-la gradualmente até uma série de concentrações para preparar uma curva-padrão.O método padrão interno de isótopos foi utilizado para a análise quantitativaO intervalo linear foi de 0,2 a 10 ng/ ml para o cloramfenicol e de 1 a 50 ng/ ml para o florfenicol aminado, tiamfenicol e florfenicol.O desvio entre os resultados da detecção linear e as concentrações conhecidas foi inferior ao desvio máximo admissível, com valores de R2 que variam de 0,9958 a 0.9998, indicando uma excelente linearidade para todos os componentes.

Quadro 4 Distribuição linear de compostos

Fig. 2 Dados da curva de calibração dos quatro compostos

3.3 LOD e LOQ

A norma nacional chinesa de segurança alimentar GB 31658.20-2022 especifica que, para este método, o limite de detecção (LOD) para o cloramfenicol é 0,1 μg/kg e o limite de quantificação (LOQ) é 0.2 μg/kg; enquanto que, para o tiamfenicol, o florfenicol e a amina florfenicol, o LOD é de 0,5 μg/kg e o LOQ é de 1 μg/kg.Os rácios sinal/ruído para todos os compostos-alvo nas concentrações especificadas do limite de detecção (LOD) e limite de quantificação (LOQ) são significativamente superiores a 3 e 10, que cumpra os requisitos de sensibilidade especificados na norma nacional.

Quadro 5 Limites de detecção e quantificação para cada composto

Fig. 3 Cromatogramas dos limites de detecção e limites de quantificação para quatro compostos

3.4 Ensaios de precisão

Tomar soluções de mistura padrão de anfenicol em concentrações baixas, médias e altas e realizar seis injecções consecutivas para comparar os desvios no tempo de retenção e na área de pico.Os resultados são apresentados no quadro seguinteOs desvios no tempo de retenção de todos os compostos de anfenicol foram inferiores a 1% e os desvios na área de pico foram inferiores a 5%,que satisfaça o requisito de precisão RSD ≤ 15% especificado na norma nacional.

Quadro 6 Ensaio de precisão para cada composto

Fig. 4 Cromatogramas de precisão de quatro compostos alcoólicos amidas

3.5 Ensaio de recuperação de spiking da matriz

A precisão deste método de detecção foi avaliada através de um teste de recuperação de picos.Preparação de amostras com picos de matriz a altas temperaturasCada nível de concentração das amostras foi analisado independentemente seis vezes.A taxa de recuperação foi calculada comparando a concentração detectada na matriz antes e após a adiçãoOs resultados são os seguintes: na matriz de frango, as taxas de recuperação de picos de todos os compostos variaram de 94,5% a 107,2%, com um CV no limite de 5%,Indicando que a precisão cumpre os requisitos do método.

Quadro 6 Taxas de recuperação de compostos na matriz de frango picado

3.6 Teste de amostragem

As amostras de peito de frango adquiridas aleatoriamente nos supermercados foram extraídas e purificadas utilizando o método de pré-tratamento da amostra acima mencionado.Nenhum dos quatro antibióticos amidas foi detectado.

Fig. 5 Cromatograma de quatro compostos alcoólicos amidas em amostras de peito de galinha de supermercado

4Conclusão

Este método utiliza o sistema Wayeal LCMS-TQ9200 de cromatografia líquida e espectrometria de massa para a determinação de antibióticos amfenicólicos em alimentos de origem animal,permitindo a aquisição simultânea de compostos em modos de íons positivos e negativosOs dados indicam que o método produz picos cromatográficos de boa forma, sem cauda, e que a sua sensibilidade satisfaz os requisitos das normas nacionais.Os coeficientes de correlação linear são todos maiores que 0.99O desvio do tempo de retenção para todos os compostos em seis injecções consecutivas é de 1% e o desvio da área de pico é de 5%, demonstrando uma boa precisão.As taxas de recuperação aumentadas na matriz de frango variam de 94Foram analisadas amostras de peito de frango adquiridas aleatoriamente nos supermercados,e nenhum dos quatro antibióticos amfenicol foi detectadoIsto demonstra que o método, equipado com o sistema de cromatografia líquida de Wayeal e espectrometria de massa,Cumprir os requisitos para a detecção qualitativa e quantitativa de rotina das amostras-alvo.