Determinação do Teor de Cafeína em Bebidas por Cromatografia Líquida

A cafeína é um alcaloide metilxantina natural amplamente presente em matérias-primas como grãos de café, folhas de chá e grãos de cacau. Ela serve como um aditivo funcional central e composto de sabor característico em bebidas comercialmente disponíveis, incluindo refrigerantes, bebidas energéticas, bebidas à base de chá e bebidas de café. A ingestão moderada de cafeína pode exercer efeitos fisiológicos como refrescar a mente e aliviar a fadiga. No entanto, o consumo excessivo e a longo prazo pode facilmente induzir reações adversas, incluindo palpitações, insônia e hiperexcitabilidade nervosa. Além disso, populações suscetíveis — como mulheres grávidas, crianças e indivíduos com doenças cardiovasculares — têm limiares de tolerância ainda mais baixos. Consequentemente, os padrões de segurança alimentar em vários países estabeleceram limites regulatórios claros para o teor de cafeína em bebidas.

Na China, a norma nacional de segurança alimentar intitulada "Determinação de Cafeína em Bebidas" (GB 5009.139-2014) serve como base legal para a determinação quantitativa de cafeína em matrizes de bebidas. A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), devido à sua excelente resolução, forte capacidade de resistir à interferência da matriz e alta precisão quantitativa, tornou-se o método de escolha para a análise de amostras de matriz complexa, incluindo várias bebidas compostas, bebidas com leite e bebidas funcionais à base de ervas. Este experimento foi conduzido de acordo com o método de cromatografia líquida de alta eficiência especificado na norma nacional GB 5009.139-2014, estabelecendo um protocolo de pré-tratamento de amostra e separação/detecção cromatográfica líquida para amostras de bebidas, e realizando a identificação qualitativa e análise quantitativa de cafeína em diferentes tipos de bebidas.

Palavras-chave: cromatografia líquida de alta eficiência; cafeína; bebidas; determinação de teor.

1. Instrumento e Reagentes

1.1 Lista de Configuração do Sistema de Cromatografia Líquida

Tabela 1. Lista de Configuração do Instrumento

1.2 Lista de Reagentes e Padrões

Tabela 2. Lista de Reagentes e Padrões

1.3 Materiais Experimentais e Equipamentos Auxiliares

Ultrassom; Mixer Vortex; Membrana de filtro de fase aquosa microporosa de 0,45 μm.

2. Método Experimental

2.1 Preparação de Soluções Padrão2.1.2 Solução Intermediária Padrão de Cafeína (200μg/mL): Transferir com precisão 5,0mL da solução estoque padrão de cafeína (2.1.1) para um balão volumétrico de 50mL e completar o volume com água. Armazenar em geladeira a 4°C. O prazo de validade é de 1 mês.

2.1.3 Soluções de Trabalho Padrão de Cafeína para Curva de Calibração: Transferir 0,5mL, 1,0mL, 2,0mL, 5,0mL e 10,0mL da solução intermediária padrão de cafeína (2.1.2) para balões volumétricos separados de 10mL e completar o volume com água. As concentrações resultantes desta série de padrões são 10,0μg/mL, 20,0μg/mL, 40,0μg/mL, 100μg/mL e 200μg/mL, respectivamente. Preparar imediatamente antes do uso.

2.2 Pré-tratamento da Amostra

2.2.1 Bebidas Tipo Cola7.167(b) Purificação: Pesar 5g da amostra (com precisão de 0,001g), transferir para um balão volumétrico de 5mL e completar o volume com água (garantindo que o teor de cafeína na solução da amostra esteja dentro da faixa da curva de calibração). Misturar bem. Adicionar 0,5g de óxido de magnésio, agitar bem e deixar em repouso. Retirar o sobrenadante e filtrá-lo através de uma membrana microporosa para análise subsequente.

2.2.2 Café Líquido com Leite e Produtos de Chá2.3 Condições Experimentais7.167Coluna: C18, 4.6 × 250mm, 5μm

Fase móvel: Metanol/água = 24/76 (v/v)Temperatura da coluna: 25°CVolume de injeção: 10μL3.1 Branco3.2 Faixa LinearTabela 3. Faixa de Linearidade do Padrão de Referência de Cafeína

Analito

Faixa Linear (μg/mL)

Coeficiente de Correlação (R)7.16710–200

1.00000

3.3 Repetibilidade

Fig 3. Cromatogramas de Repetibilidade do Padrão de Referência de Cafeína (n = 6)

Tabela 4. Parâmetros Cromatográficos de Repetibilidade para Padrão de Referência de Cafeína (n = 6)

Nº.

Nome da AmostraTempo de Retenção (min)Área do Pico (mAU·s)Cafeína 100μg/mL

7.192

2842.304

27.1672843.223

3

7.1584

7.167

2841.149

5

7.167

2844.688

6

0.014

1.831

RSD (%)

3

Cafeína

7.225

Pico 3

2.908

n.a.

133.521 μg/mLNome do Composto

Tabela 8. Resultados Cromatográficos para Recuperação de Adição em uma Certa Marca de Amostra de Bebida de Chá com Leite (Concentração de Adição: 40μg/mL)Nome do Composto

7.217

163.054

Limite de Detecção (mg/kg)

1

Cafeína