Determinação de Resíduos de Eritromicina em Resíduos de Fermentação Antibiótica Usando o Sistema de Cromatografia Líquida-Espectrometria de Massas Wayeal LCMS-TQ9200

A eritromicina é um antibiótico macrolídeo produzido pela fermentação de Streptomyces erythreus. Exerce seu efeito antibacteriano principalmente inibindo a síntese de proteínas bacterianas. A produção de eritromicina depende principalmente da tecnologia de biofermentação, envolvendo etapas como seleção de cepas, cultura de sementes, fermentação em larga escala em tanques, extração e purificação. Após a fermentação, a eritromicina é extraída com solventes orgânicos (como acetato de butila), seguida de purificação por cristalização ou separação por resina de troca iônica, resultando, em última análise, em sais de grau clínico (por exemplo, etilsuccinato de eritromicina). No entanto, o processo de produção de eritromicina gera uma quantidade significativa de borras miceliais (resíduo de fermentação), que pode conter antibióticos residuais, proteínas microbianas e subprodutos metabólicos. Se não forem gerenciados adequadamente, esses resíduos podem entrar na cadeia ecológica por meio de descarga ambiental ou uso como aditivos para ração, levando a múltiplos perigos: A eritromicina residual pode promover a disseminação de genes de resistência a antibióticos no solo e corpos d'água, perturbando o equilíbrio da comunidade microbiana; amplificada por meio da cadeia alimentar, pode induzir o surgimento de cepas bacterianas resistentes em animais ou humanos, minando a eficácia dos antibióticos; além disso, a matéria orgânica subutilizada dentro dos resíduos pode causar poluição ambiental. Portanto, a regulamentação rigorosa dos resíduos miceliais é uma medida crítica para controlar a poluição da produção de eritromicina.

Este experimento foi conduzido com referência ao padrão "T/PIAC 00003—2021 Padrão do Grupo da China Pharmaceutical Industry Association - Método para a determinação de eritromicina em resíduos de antibióticos, materiais de base de fertilizantes orgânicos, culturas e meios ambientais", utilizando o sistema de espectrometria de massa cromatográfica líquida Wayeal LCMS-TQ9200 para determinar o teor de eritromicina nas borras miceliais. Os resultados experimentais indicam que o teste de adequação do sistema demonstrou boa forma de pico e boa linearidade, atendendo aos requisitos experimentais.

1. Instrumentos e Reagentes

1.1 Lista de Configuração de LCMS

Tabela 1 Lista de Configuração de Instrumentos

1.2 Reagentes e Padrões

Tabela 2 Lista de Reagentes e Padrões

1.3 Material Experimental e Equipamento Auxiliar

Limpeza ultrassônica

Misturador vortex

Centrífuga de alta velocidade

2. Método Experimental

2.1 Pré-tratamento da Amostra

Pesar 0,5g da amostra (precisão de 0,001 g) em um tubo de ensaio com tampa de vidro. Adicionar 50mL de acetonitrila, vortex por 1 minuto para homogeneizar a mistura e realizar extração assistida por ultrassom por 20 minutos. Em seguida, transferir a mistura para um tubo de centrífuga de 50mL e centrifugar a 4000rpm por 10 minutos. Coletar uma quantidade apropriada do sobrenadante e passá-lo por uma membrana filtrante de 0,22μm. Descartar pelo menos 1mL do filtrado inicial, em seguida, transferir o filtrado restante para um frasco LC âmbar para análise.

2.2 Condições do Experimento

2.2.1 Condições do Método de Cromatografia Líquida

Coluna de cromatografia: C18 1,7μm 2,1x50mm

Fase móvel: A: Acetonitrila, B: Ácido fórmico a 0,1% em água

Vazão: 0,3mL/min

Temperatura da coluna: 30℃

Volume de injeção: 2μL

2.2.2 Condições do Método de Espectrômetro de Massa

Tabela 3 Parâmetros da Fonte de Íons de Espectrometria de Massa

3. Resultado do Experimento

3.1 Teste de Adequação do Sistema

Os resultados do teste de adequação do sistema mostraram picos-alvo bem definidos sem interferência de picos estranhos, atendendo a todos os requisitos experimentais.

Fig 1 Cromatograma da Solução de Trabalho Padrão de Eritromicina A (0,5ng/mL)

3.2 Faixa Linear

A curva de calibração para eritromicina A foi preparada diluindo serialmente a solução padrão usando soluções de trabalho de concentração intermediária. A curva demonstrou excelente linearidade na faixa de 0,5-500ng/mL, com um coeficiente de correlação (R²) maior que 0,99.

Tabela 4 Faixa Linear de Eritromicina A

Fig 2 Curva de Calibração para Eritromicina A

3.3 Limite de Detecção (LOD) e Limite de Quantificação (LOQ)

Neste método, o limite de detecção (LOD) e o limite de quantificação (LOQ) para a solução padrão de eritromicina A foram determinados como 0,2ng/mL e 0,5ng/mL, respectivamente. As relações sinal-ruído (S/N) correspondentes foram 110,02 e 292,20, excedendo substancialmente os requisitos mínimos de 3 e 10, cumprindo assim os critérios de sensibilidade experimental.

Figura 3. Cromatogramas de Íons Extraídos para o LOD e LOQ de Eritromicina A

3.4 Teste de Precisão

A solução de eritromicina A foi injetada consecutivamente sete vezes, com os resultados mostrados na figura abaixo. O desvio do tempo de retenção para eritromicina A foi de 0,19% e o desvio da área do pico foi de 0,96%, ambos abaixo de 5%, atendendo aos requisitos experimentais.

Figura 4. Cromatogramas de Precisão da Amostra de Eritromicina A (7 Injeções)

3.5 Teste da Amostra

Seguindo o método de pré-tratamento mencionado, a área do pico-alvo na amostra sólida foi de 7,4E6. Calculado via método do padrão externo, o teor de eritromicina A na solução da amostra foi determinado como 400 ng/mL.

Fig 5 Cromatograma do Teste da Amostra de Eritromicina A

4. Conclusão

Este método utiliza o sistema de espectrometria de massa cromatográfica líquida Wayeal LCMS-TQ9200 para a determinação do teor de eritromicina A em resíduos de fermentação de antibióticos. Os dados indicam que o método demonstra excelente desempenho: todos os picos cromatográficos exibem forma ideal sem cauda, e a sensibilidade atende aos requisitos experimentais. O coeficiente de correlação linear (R²) excede 0,99. Os desvios do tempo de retenção e da área do pico para todos os compostos em sete injeções consecutivas estão dentro de 1%, indicando alta precisão. Os cromatogramas da amostra não mostram interferência de picos estranhos, e o teor da amostra medida é de 400ng/mL. Este método, equipado com o sistema Wayeal LC-MS/MS, atende aos requisitos para análise qualitativa e quantitativa de rotina das amostras de teste.