Determinação da rodamina B no pó de pimenta-do-reino pelo sistema WAYEAL LCMS-TQ9200 LCMS/MS

A Rodamina B (também referida como Vermelho Rosa B ou Violeta Básico 10) é um corante fluorescente básico sintético que pertence à classe química das xantenas. Esta substância em si exibe uma cor vermelho-rosa brilhante e é facilmente solúvel em solventes polares como água e etanol. Inicialmente, foi amplamente utilizada em campos industriais, incluindo têxteis, impressão e rotulagem fluorescente. Devido ao seu baixo custo e forte capacidade de coloração, alguns comerciantes inescrupulosos a adicionaram ilegalmente a produtos alimentícios para fins de tingimento, como pimenta em pó, pimenta de Sichuan, produtos cárneos e temperos, tornando-a um contaminante importante que põe em risco a segurança alimentar.
A Rodamina B é claramente tóxica para o corpo humano. Ela pode entrar no corpo através do trato digestivo ou da pele, interferindo no metabolismo fisiológico normal. Além disso, apresenta riscos potenciais de carcinogenicidade e mutagenicidade. Como resultado, foi classificada como substância não comestível proibida em alimentos por vários países. É um alvo chave da supervisão da segurança alimentar, e sua taxa de detecção permanece persistentemente alta em vários temperos e alimentos processados.

Nesta nota de aplicação, um método de cromatografia líquida-espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS) para a determinação de Rodamina B em alimentos foi estabelecido utilizando o sistema de cromatografia líquida-espectrometria de massa em tandem WAYEAL LCMS-TQ9200. Este método alcança extração eficiente, separação precisa e quantificação sensível do analito alvo, eliminando efetivamente as interferências da matriz alimentar. Ele oferece suporte técnico confiável para triagem rápida e quantificação precisa de Rodamina B em alimentos, facilitando assim a supervisão eficaz da segurança alimentar.

Palavras-chave: Segurança alimentar, Rodamina B, LCMS/MS

1. Instrumentos e Reagentes

1.1 Configuração do Instrumento

Tabela 1 Lista de Configuração do Instrumento

1.2 Lista de Reagentes e Padrões

Tabela 2 Lista de Reagentes e Padrões

1.3 Material Experimental e Equipamento Auxiliar

Vórtex

Centrífuga de alta velocidade

Balança analítica

Manifold de extração em fase sólida (SPE) (com bomba de vácuo)

Evaporador de nitrogênio

Agitador orbital

2. Método Experimental

2.1 Preparação de Soluções

2.1.1 0,1% de Ácido Fórmico em Água: Transfira 1 mL de ácido fórmico para 500 mL de água, misture bem e complete o volume para 1000 mL com água.

2.1.2 0,1% de Ácido Fórmico em Acetonitrila: Transfira 1 mL de ácido fórmico para 500 mL de acetonitrila, misture bem e ajuste o volume para 1000 mL com acetonitrila.

2.1.3 50% de Metanol em Água: Transfira precisamente 500 mL de metanol para um balão volumétrico de 1 L, em seguida, complete o volume com água.

2.1.4 50% de Metanol em Água com 0,1% de Ácido Fórmico: Transfira 1 mL de ácido fórmico para 500 mL de 50% de metanol em água, misture bem e dilua para o volume de 1000 mL com 50% de metanol em água.

2.1.5 5% de Amônia em Metanol: Transfira 5 mL de solução de amônia para um balão volumétrico de 100 mL, dilua até o volume com metanol e misture bem.

2.2 Pré-tratamento da Amostra

2.2.1 Extração da Amostra

Pese com precisão 1 g de amostra de pimenta em pó em um tubo de centrífuga de plástico de 50 mL. Adicione precisamente 10,0 mL de solução aquosa de metanol a 50% contendo 0,1% de ácido fórmico e misture bem. Adicione dois homogeneizadores cerâmicos, em seguida, agite em vórtex por 15 minutos em um vórtex. Centrifugue a 8000 rpm por 10 minutos. Transfira 3 mL do sobrenadante (camada de extrato) e filtre através de uma membrana de filtro de fase orgânica de 0,45 μm antes da purificação.

2.2.2 Purificação da Amostra

Condicionamento do Cartucho de Extração em Fase Sólida (SPE) NovaPre MCX: Antes do uso, ative sequencialmente o cartucho com 3 mL de metanol e 3 mL de água.

Transfira precisamente 1,0 mL do extrato para o cartucho de extração em fase sólida (SPE) NovaPre MCX. Lave sequencialmente o cartucho com 3 mL de 0,1% de ácido fórmico em água, 3 mL de água e 3 mL de metanol. Elua o analito alvo com 6 mL de solução de amônia em metanol e colete o eluato. Evapore o eluato até quase secar sob um fluxo de nitrogênio a 45 °C. Dissolva o resíduo em 0,5 mL da fase móvel inicial, filtre através de uma membrana de filtro de fase orgânica de 0,22 μm e, em seguida, injete o filtrado para análise instrumental.

2.3 Condições Experimentais

2.3.1 Condições de HPLC

Coluna cromatográfica: C18, 1.7 μm, 2.1*50mm;
Fase móvel: Fase A: 0,1% de ácido fórmico em água; Fase B: 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila;
Taxa de fluxo: 0,4 mL/min;
Temperatura da coluna: 40 °C;
Volume de injeção: 1 μL.

2.3.2 Condições de Espectrometria de Massa

Tabela 3 Parâmetros de Espectrometria de Massa do Composto

Nota: * Íon quantificador.

3. Resultado Experimental

3.1 Cromatograma de Padrões

A detecção de Rodamina B foi concluída em menos de 7 minutos. Conforme mostrado na Figura 1, o pico do composto exibiu boa forma de pico e resposta satisfatória, atendendo aos requisitos para determinação experimental.

Fig 1 Cromatograma de Rodamina B

3.2 Faixa Linear

Uma quantidade apropriada de solução de trabalho padrão de Rodamina B foi transferida com precisão e diluída com a fase móvel inicial para preparar a curva padrão. A faixa linear foi de 0,1 a 10 ng/mL. O desvio entre os resultados lineares e as concentrações conhecidas ficou dentro do desvio máximo permitido. O coeficiente de determinação (R²) foi superior a 0,999, indicando boa linearidade.

Fig 2 Curva Padrão de Rodamina B

3.3 Limite de Quantificação e Limite de Detecção

Neste método, o limite de detecção (LOD) e o limite de quantificação (LOQ) para Rodamina B foram estabelecidos em 0,1 ng/mL e 0,5 ng/mL, respectivamente. As razões sinal-ruído (S/N) correspondentes são resumidas na tabela abaixo. As razões S/N no LOD excederam 3, enquanto as no LOQ excederam 10.

Tabela 4 Limite de Quantificação e Limite de Detecção

Fig 3 Razão Sinal-Ruído no LOD para Rodamina B (0,1 ng/mL)

Fig 4 Razão Sinal-Ruído no LOQ para Rodamina B (0,5 ng/mL)

3.4 Repetibilidade

Soluções padrão em três concentrações (0,5, 2 e 5 ng/mL) foram injetadas seis vezes consecutivamente. Os resultados são mostrados na tabela abaixo. Os desvios padrão relativos (RSDs) do tempo de retenção e da área do pico para Rodamina B em concentrações baixa, média e alta ficaram todos dentro de 5%, atendendo aos requisitos experimentais.

Tabela 5. Teste de Repetibilidade para Rodamina B em Concentrações Baixa, Média e Alta

Fig 5 Cromatogramas de 6 Injeções Consecutivas de Rodamina B 0,5 ng/mL

Fig 6 Cromatogramas de 6 injeções consecutivas de Rodamina B 2 ng/mL

Fig 7 Cromatogramas de 6 injeções consecutivas de Rodamina B 5 ng/mL

3.5 Recuperação de Spike

A Amostra A foi fortificada com uma solução padrão para aumentar a concentração de Rodamina B em 2 ng/mL. Seis injeções replicadas foram então analisadas. A recuperação obtida foi de 105,7% com um RSD de 1,473%, satisfazendo os critérios de aceitação do método.

3.6 Carryover

Após a injeção da solução padrão de 10 ng/mL, um solvente em branco foi injetado para avaliar o carryover. Os resultados são mostrados na figura abaixo. O carryover no branco foi inferior a 10% do padrão de calibração mais baixo (0,1 ng/mL), atendendo aos requisitos experimentais.

Fig 8 Cromatograma em Branco do Composto

3.7 Teste de Amostra

A concentração de Rodamina B na Amostra A estava abaixo do limite de detecção do método (MDL).

Fig 9 Cromatograma de Rodamina B na Amostra A

4. Conclusão

Neste estudo, um método de cromatografia líquida-espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS) para a determinação de Rodamina B foi estabelecido utilizando o sistema WAYEAL LCMS-TQ9200. Os dados obtidos demonstraram que o método produziu picos cromatográficos com boa simetria e sem cauda, e a sensibilidade atendeu aos requisitos experimentais. O coeficiente de determinação (R²) foi superior a 0,999, satisfazendo os critérios de linearidade. A repetibilidade (RSD) em concentrações baixa, média e alta ficou dentro de 5%, e o carryover no branco foi inferior a 10% do padrão de calibração mais baixo. Esses resultados indicam que o método, quando acoplado ao sistema WAYEAL LC-MS/MS, é capaz de atender aos requisitos de detecção qualitativa e quantitativa de rotina para analitos alvo.