Determinação de Espectinomicina por Cromatografia Líquida de Alta Performance Wayeal com Detector ELSD

O Detector de Dispersão de Luz Evaporativa (ELSD) é um novo detector de massa com aplicabilidade teórica a qualquer composto que possa formar partículas gasosas. A edição de 2025 da Farmacopeia especifica o uso da Detecção por Dispersão de Luz Evaporativa (ELSD) para a análise e controle de qualidade de mais de 100 variedades de medicamentos. Na prática, o ELSD é aplicado com mais frequência a compostos que não possuem absorção ultravioleta (UV), como astragalosídeo, carboidratos, aminoglicosídeos e colesterol, muitas vezes servindo como um método de detecção complementar aos detectores UV e de fluorescência. No entanto, os resultados do ELSD são influenciados por múltiplos fatores, incluindo a composição da fase móvel, a concentração do solvente orgânico, o modo de eluição e as condições de nebulização. Portanto, para garantir resultados analíticos precisos e consistentes, é essencial avaliar o impacto desses fatores nos resultados.
Este estudo, referenciando o método analítico para cloridrato de espectinomicina da Parte II da Farmacopeia de 2025 e guiado pelos princípios ICH QbD, empregou um projeto experimental ortogonal para triar e otimizar as condições analíticas.

Fig 1 Cloridrato de Espectinomicina

2. Instrumento e Método

Neste estudo, a análise cromatográfica foi realizada usando o sistema HPLC da série LC3200 da Wayeal. A configuração do instrumento incluiu uma bomba de gradiente quaternário, um amostrador automático, um compartimento de coluna e um Detector de Dispersão de Luz Evaporativa. O controle do sistema e a aquisição/processamento de dados foram realizados com o software de cromatografia SmartLab 2.0.

Tabela 1 Condições de HPLC

3. Preparação da solução

Solução da amostra: A solução estoque de cloridrato de espectinomicina foi fornecida pelo cliente com uma concentração rotulada de 10 mg/mL e uma pureza de 99,8%.

Solução aquosa de ácido trifluoroacético 0,1M：Pipetar precisamente 6,8 mL de ácido trifluoroacético em um balão volumétrico de 1000 mL. Diluir até a marca com água purificada e misturar bem. Finalmente, filtrar a vácuo a solução através de um filtro de membrana de celulose de 0,45μm antes de usar.

Soluções padrão: A solução estoque foi diluída com água purificada para preparar soluções de amostra com concentrações de 0,15, 0,25, 0,35, 0,50 e 0,70 mg/mL, respectivamente. Cada solução foi então filtrada através de um filtro de membrana de celulose de 0,45μm antes de usar.

4. Resultado e Discussão

A Farmacopeia Chinesa emprega condições cromatográficas idênticas para analisar substâncias relacionadas e o conteúdo do componente principal sob a entrada de cloridrato de espectinomicina. O método afirma que "o detector pode ser configurado com base nas circunstâncias reais". Durante o estudo, considerando as características instrumentais do ELSD3260, os requisitos do método analítico e a literatura relevante, um projeto experimental de Plackett-Burman foi empregado para triar múltiplos parâmetros experimentais (Tabelas 2 e 3). Posteriormente, um projeto de Box-Behnken (Tabela 4) foi utilizado para otimizar a resposta da área do pico do detector ELSD.

Tabela 2 Projeto Experimental de Plackett-Burman

Tabela 3 Análise ANOVA dos Resultados Experimentais de Plackett-Burman

Como pode ser visto na Tabela 3, a vazão de gás, a vazão da fase móvel e a compensação pós-coluna mostraram efeitos negativos. Especificamente, reduzir a vazão de gás e a vazão da fase móvel, juntamente com a desativação da compensação pós-coluna, poderia aumentar a resposta do pico cromatográfico. No entanto, diminuir a vazão da fase móvel pode levar ao aumento do alargamento do pico e à redução da sensibilidade da detecção. Portanto, a vazão foi mantida consistente com o método padrão. Embora a temperatura da coluna e a temperatura de detecção tenham exibido efeitos positivos, elas não aumentaram significativamente o valor da resposta. Consequentemente, estudos subsequentes se concentrarão na otimização da vazão de gás, da temperatura do nebulizador e da temperatura do evaporador.

Os efeitos da vazão de gás, da temperatura do nebulizador e da temperatura do evaporador no valor da resposta foram investigados empregando um projeto experimental de Box-Behnken dentro de uma estrutura de metodologia de superfície de resposta. O projeto experimental é apresentado na Tabela 4.

Tabela 4 Projeto Experimental de Box-Behnken

As condições de detecção para cloridrato de espectinomicina foram determinadas simulando a variação da área do pico usando a metodologia de superfície de resposta (Figura 2) e considerando as faixas de parâmetros instrumentais: temperatura do nebulizador 85°C, temperatura do evaporador 80°C, temperatura do detector 50°C e vazão de gás 0,2 SLM.

A. Efeito da Vazão de Gás e da Temperatura do Evaporador na Área do Pico

B. Efeito da Vazão de Gás e da Temperatura do Nebulizador na Área do Pico

C. Efeito da Temperatura do Nebulizador e da Temperatura do Evaporador na Área do Pico

Fig 2 Variação na Área do Pico

Precisão da Injeção

A solução estoque de cloridrato de espectinomicina foi diluída para 0,35 mg/mL, e seis injeções consecutivas foram realizadas sob as condições cromatográficas especificadas com os cromatogramas registrados. Os desvios padrão relativos (RSD%) do tempo de retenção e da área do pico para o pico cromatográfico de cloridrato de espectinomicina foram calculados. Os resultados são mostrados na Tabela 5.

Tabela 5 Resultados do Teste de Precisão da Injeção

Especificidade

De acordo com a diretriz ICH Q2(R2) sobre validação de procedimento analítico e o Capítulo Geral da Farmacopeia Chinesa 〈9101〉 Diretrizes sobre Validação de Métodos Analíticos, o método otimizado foi validado para especificidade, faixa linear, precisão e repetibilidade.

Água purificada e a solução da amostra (0,35 mg/mL) foram analisadas em paralelo com os cromatogramas registrados. Os resultados (Figura 3) não mostraram nenhum pico cromatográfico no tempo de retenção do cloridrato de espectinomicina no cromatograma de água purificada, enquanto o pico para cloridrato de espectinomicina na solução da amostra alcançou a separação da linha de base dos picos adjacentes (R > 1,5).

Fig 3 Resultados Analíticos da Amostra de Cloridrato de Espectinomicina (0,35mg/mL)

Faixa Linear

Prepare três amostras paralelas da solução estoque de cloridrato de espectinomicina de acordo com o método de preparação da solução padrão, analise-as sob condições cromatográficas e registre os cromatogramas. Realize a análise de regressão usando as áreas dos picos cromatográficos e as concentrações correspondentes.

Fig 4 Resultados do Teste de Linearidade (Transformados em Log vs. Não Transformados)

De acordo com a literatura, a relação entre o valor da resposta ELSD e a concentração é não linear, exigindo a transformação logarítmica tanto do valor da resposta quanto da concentração antes de realizar a análise de regressão [8,9,10]. Após aplicar a transformação logarítmica aos dados experimentais, o coeficiente de correlação da curva de regressão linear excedeu 0,999, o que é significativamente melhor do que o resultado obtido sem a transformação logarítmica (como mostrado na Figura 4).

Precisão e Repetibilidade

A solução estoque de cloridrato de espectinomicina foi diluída para concentrações de 0,25, 0,35 e 0,50 mg/mL. Para cada concentração, três amostras paralelas foram preparadas, analisadas sob as condições cromatográficas especificadas e os cromatogramas foram registrados. O conteúdo foi calculado usando a curva de regressão, e a recuperação e a repetibilidade foram avaliadas. Os resultados são apresentados na Tabela 6.

Tabela 6 Resultados do Teste de Recuperação

Limite de Quantificação (LOQ)

Dilua a solução estoque de cloridrato de estreptomicina para uma concentração de 12μg/mL. Analise a amostra sob condições cromatográficas e registre o cromatograma. Calcule a relação sinal-ruído (S/N) do pico cromatográfico de cloridrato de estreptomicina e determine sua repetibilidade. Os resultados são mostrados na Tabela 7.

Tabela 7 Resultado do Teste de LOQ

Os resultados indicam que, sob o requisito da diretriz ICH de S/N > 10, o desvio padrão relativo da área do pico para esta concentração de solução de cloridrato de espectinomicina atende aos critérios. Portanto, pode servir como o padrão limite de quantificação para cloridrato de espectinomicina.

5. Conclusão

Com base no método farmacopeico, este estudo estabeleceu um procedimento analítico confiável e robusto para a quantificação do cloridrato de espectinomicina. As condições do detector de dispersão de luz evaporativa (ELSD) foram sistematicamente otimizadas. O método otimizado demonstrou estabilidade e precisão aprimoradas, maior sensibilidade de detecção e uma faixa linear satisfatória.

O detector ELSD3260 é um detector de fluxo dividido e de baixa temperatura recém-projetado e desenvolvido. É adequado para a análise de substâncias não voláteis e semivoláteis, fornecendo uma alternativa valiosa para compostos que não possuem absorção UV. Neste estudo, o uso do ELSD3260 para a análise de cloridrato de espectinomicina resultou em excelentes valores de resposta e reprodutibilidade, juntamente com maior sensibilidade de detecção. Essas descobertas demonstram que este instrumento é adequado para a análise quantitativa de cloridrato de espectinomicina.